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Eine neu entdeckte Freiheit: Der Spieler wird Missionen ausführen können, wann er will und wie er will. Die offene Welt bringt das freie Fortbewegen des ersten Teils zurück und fügt neue Elemente wie Schwimmen und sogar Fliegen hinzu. Die neuen Spielmöglichkeiten sorgen dafür, dass der Spieler das Spiel so durchspielen kann, wie er es möchte.
Dynamische Massen: Der Spieler entdeckt eine lebendige Welt, in der jeder Charakter auch eine Chance für den Spieler bedeutet.
Das Verschwinden in der Masse erleichtert Ezios Aufgaben, die Zusammenarbeit mit anderen Charaktern kann sowohl Belohnung bedeuten, als auch für unvorhergesehene Konsequenzen sorgen.
Ein Meister-Assassine werden: Fähigkeiten müssen perfektioniert werden, um ein Meister-Assassine zu werden, neue Waffen nutzen zu können, Feinde zu entwaffnen und Waffen gegen diese einzusetzen oder Feinde mit versteckten Klingen zu überwältigen.

Ezio Auditore de Firenze ist ein junger italienischer Adliger, der die Wege der Assassinen kennenlernen will, um Vergeltung üben zu können, nachdem seine Familie Opfer eines tödlichen Betrugs wurde.
Durch ihn wird der Spieler zum Meister-Assassinen.

Das Italien des 15. Jahrhunderts war weniger ein geeintes Land, als vielmehr eine Ansammlung an Stadtstaaten, in denen Familien mit politischem Einfluss und finanziellen Möglichkeiten begannen, die Macht über Städte wie Florenz oder Venedig an sich zu reißen.
Diese Reise durch einige der schönsten Städte der Welt findet in einer Zeit statt, die als Geburtsstunde von Kultur und Kunst gilt, aber immer begleitet von Korruption, Habgier und Mord.